플라스미드 pCTHB20에 의해 형질전환된 대장균 JM109 균주는 베타갈락토시다제-프리 S2 융합 단백질을 총 세포 단백질의 50% 정도로 생산하였다 (Choi et al., 1988). 이 융합 단백질로부터 시안브롬을 사용하여 프리 S2 펩티드를 절단하여 정제하는 것을 보다 더 용이하게 하기 위해 베타갈락토시다제 유전자 (lacZ) 서열을 재배열하여 pCTHB30을 제조하였으며, 또한 lacZ 서열 내부에 존재하는 메치오닌 코돈을 올리고뉴클레오티드에 의한 변이유도 방법을 사용하여 발린코돈으로 치환하였다. 플라스미드 pCTHB2에 존재하는 lacZ 서열을 포함하는 EcoRI-XbaI DNA 절편을 분리하여 파지 M13 mp18 백터의 멀티크로닝 부위에 삽입하였고, 원하는 변이를 포함하는 두개의 상보쇄 서열 (각각 17-mer)을 합성하여 동시에 프라이머로 사용하였다. 변이클론들은 $^{32}P$로 표지된 변이 올리고뉴클레오티드를 프로브로 사용하여 DNA 하이브라디제이션 방법에 의해 선별하였으며, 치환된 뉴클레오티드는 DNA 염기서열 분석에 의해 확인하였다. 변이 lacZ 서열로 치환하여 제조된 pCMHB20 및 PCMHB3에 의해 형질전환된 대장균 JM109 균주들도 pCTHB20 및 PCTHB30을 포함하는 균주와 거의 같은 효율로 프리 S2 서열을 지닌 융합 단백질을 생산하였다.
E. coli JM109 cells harboring pCTHB20 plasmid overproduced ${eta}$-galactosidase-preS2 ($eta$ gal-preS2) fusion proteins with a yield of 50% of total cellular proteins (Choi et al., 1988). In order to facilitate the isolation of preS2 peptide out of the fusion protein after CNBr cleavage, the lacZ sequence was rearranged to construct pCTHB30 plasmid. Two internal methionine codons in the lacZ region of pCTHB20 and pCTHB30 was also substituted with valine codons by oligonucleotide-directed mutagenesis. The EcoRI-XbaI restriction fragment of lacZ was isolated from the plasmid pCTHB20 and was inserted into multicloning site of M13 mp18 vector. Two synthetic complementary oligonucleotides (17-mer each) with desired nucleotide changes were used simultaneously as primers in synthesizing a complementary strand. Mutant clones were screened by DNA hybridization with probes of $^{32}P$-labeled mutagenic oligonucleotides, and the nucleotide substitutions were confirmed by DNA sequencing. E. coli JM109 cells transformed with pCMHB20 and pCMHB30 in which the lacZ regions were substituted with the mutant counterpart produced ${eta}$ gal-preS2 fusion proteins as efficiently as those with pCTHB20 and pCTHB30.
