목적 : K562 세포를 대상으로 PTK inhibitor (herbimycinA와 genistein)에 의한 방사선 유도 apoptosis의 변화에 따른 관련 유전자를 탐색하고자 하였다. 대상 및 방법 : K562 세포는 $2 imes10^5;cells/mL$의 비율로 준비하여 대수증식기로 성장한 세포를 각각의 실험조건에 따라 처리하여 사용하였다. 방사선 조사는 6-MV X-Ray 10 Gy (Clinac 1800C, Varian, USA)를 $200~300;cGy/min$의 선량율로 상온에서 일정하게 조사하였다. Herbimycin A (HMA, Calbiochem, UK)와 genistein (Calbiochem, UK)은 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, UK)에 녹여서 각각 1 mM과 10 mM의 농축용액으로 조제한 각각 250 nM과 $25;{mu}M$의 최종농도로 처리하였다. 내성 변화의 조절에 관여하는 유전자를 찾고자 PCR-select cDNA subtractive hybridization을 실시하여 128개의 차별 발현되는 clones을 재선별하였다. DNA sequencing을 통하여 염기서열을 분석하였으며, GenBank database를 이용하여 이미 밝혀진 유전자들과의 상동성을 비교하였다. 상동성을 갖는 clone을 확인하여 이를 probe로 사용하여 방사선 단독조사한 실험군과 방사선과 HMA 또는 genistein을 동시 처리한 실험군들간의 mRNA 발현의 차이를 Northern hybridization을 통하여 확인하였다. 결과 : homo sapiens Smad6 유전자와 $95\%$의 상동성을 갖는 clone을 확인하였다. 이를 probe로 사용하여 방사선 단독 조사한 실험군과 방사선과 HMA 또는 genistein을 동시 처리한 실험군들간의 mRNA 발현의 차이를 비교 분석한 결과, 방사선과 genistein을 동시 처리한 실험군의 mRNA 발현이 방사선 단독 조사한 실험군과 방사선과 HMA를 처리한 실험군들에 비하여 현저히 높았다. 결론 : Smad6와 방사선에 의해 유도되는 apoptosis의 억제에 관한 연관성을 보고한 문헌은 없으나, Smad6가 일부세포에서 apoptosis를 억제한다는 보고들과, 본 연구에서 관찰한 genistein에 의한 방사선에 의해 유도되는 apoptosis의 억제에서 그 발현이 두드러지게 증가한 점 등을 미루어 보아 방사선에 의하여 유도된 apoptosis의 억제 및 방사선 내성의 조절에도 관여할 것으로 생각된다.
Prupose : The genes involved on the suppression or radiation-induced apoptosis by genistein in K562 leukemia cell line was investigated. Materials and methods : K562 cells in exponential growth phase were irradiated with a linear accelerator at room temperature. For X-ray irradiation and drug treatment, cultures were prepared at $2 imes10^5;cells/mL$. The cells were irradiated with 10 Gy (Clinac 1800C, Varian, USA), Stock solutions of herbimycin A (HMA, Calbiochem, UK) and genistein (Calbiochem, UK) were prepared in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, UK). After incubation at $37^{circ}C$ for 24 h, PCR-select cDNA subtractive hybridization, dot hybridization, DNA sequencing and Northern hybridization were examined. Results : Smad6 gene was identified from the differentially expressed genes in K562 cells incubated with genistein which had been selected by PCR-select cDNA subtractive hybridization. The mRNA expression of Smad6 in K562 cells incubated with genistein was also higher than control group by Northern hybridization analysis. Conclusion : We have shown that Smad6 involved on the suppression of radiation-induced apoptosis by genistein in K562 leukemia cell line. It is plausible that the relationship between Smad6 and the suppression of radiation-induced apoptosis is essential for treatment development based on molecular targeting designed to modify radiation-induced apoptosis.
