재조합 생물의약품 생산시, 오염물질의 유래는 외인성(외래성 바이러스, 마이코플라즈마, 미생물) 및 내인성(생산세포주 유래 단백질) 두 가지의 일반적인 가능성으로 존재한다. 이 중 생산세포주 유래의 불순 단백질은 환자에게 면역이상반응을 일으킬 수 있어 제품의 안정성과 사용자의 안전상의 문제가 될 수 있다. 따라서 이들 단백질의 오염 여부를 검출하는 방법의 개발이 요구된다. 상용화된 분석제품들은 일반적인 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 가능하지만, 생산 방법이나 재조합 된 세포의 특성에 따라 달라질 수 있는 고유한 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 적합하지 못하다. 본 연구에서는 재조합 항체의약품 생산과 정제과정에서 목적단백질의 생산 유전자를 지니지 않는 null cell mock 배양에 의해 생산세포주 유래 모든 단백질을 얻어 이에 대한 다클론항체를 제작하여 면역학적 반응을 이용하여 생산세포주 유래 단백질을 정량 할 수 있는 ELISA 방법을 개발하였다. 생산세포주 유래 단백질에 대한 다클론항체는 rabbit에서 얻었으며, 이 중 생산세포주 유래 단백질에 특이적인 항체만을 정제하였다. 또한 direct sandwich ELISA 방법 개발을 위해 항체에 발색효소(HRP)를 표지하였다. 이렇게 만들어진 항체를 이용하여 정성분석을 위한 Western blot과 정량분석을 위한 ELISA 방법을 개발하여 목적단백질의 정제과정 내에서 생산세포주 유래 단백질이 제거되는 것을 확인하였다. 또한 개발된 ELISA 방법은 ICH 규정에 따라 validation을 실시한 결과 되어 객관적 검증을 받은 결과, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성의 기준을 만족하며 검출한도가 10.8 ppm인 방법임을 확인하였다.
The purpose of this study was to develop a assay system of host cell-derived residual proteins in final pharmaceutical products. Accurate and simple assay system for host cell-derived proteins(HCPs) is very important test item in pharmaceutical qualification control. In this study, methods for quantification of residual HCPs in recombinant anti-GPIIbIIIa antibody were developed using a process-specific immunoligand assay which was based on the Enzyme linked Immunosorbent assay(ELISA) system. The assay had a detection limit of 10.8 ng/ml of HCPs with a product concentration of 1 mg/ml. The practical implication of these results is that the developed ELISA system can be used for HCPs qualification control and this system will be applicable to develop another ELISA system of different antibody drug.
