$eta$-Lactam계 항생물질에 강한 내성을 가지는 균주 Bacillus sp. J105가 생산하는 $eta$-lactamase의 유전자를 E. coli DH5$alpha$에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI 으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 $eta$-lactamase양성 clone주를 획득하였다. 이 recombinant plasmid ($eta$-lac+)를 pACYC184 (4.2kb) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 $eta$-lactamase의 활성이 있는 6.4 kb 단편이 포함된 pKL11${Delta}4.6$을 제작하였다. 이 단편을 DNA 염기서열을 분석한 결과 309개의 아미노산으로 구성된 $eta$-lactamase를 코딩하는 927 bp를 포함하고 있었다. 클로닝된 $eta$-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 170 bp의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 $eta$-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 $eta$-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 $eta$-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 $eta$-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus 와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다. 이 pKL11-${Delta}4.6$를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 $eta$-lactamase의 secretion efficiency는 약 $4{sim}5%$％였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 $eta$-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 31 kDa로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.
The $eta$-lactamase gene was cloned into E. coli DH5$alpha$ from Bacillus sp. J105 with strong resistance against $eta$-lactam antibiotics. The chromosomal DNA was partially digested with Sau3AI and ligated to BamHI digested pLAFR3. $eta$-Lactamase positive clones were obtained by using in vitro packaging kit. The pKL11-${Delta}4.6$ with $eta$-lactamase activity was obtained by subcloning of the recombinant plasmid ($eta$-lac +). The 6.5 kb fragment in the subcloned plasmid was sequenced. The DNA fragment that contains the $eta$-lactamase gene encodes 309 amino acids. The 0.17 kb upstream region was similar to those of B. thuringinesis and B. cereus with 97% identity. The deduced amino acids sequence was also similar to those of $eta$-lactamase from B. thuringinesis and B. cereus with 97% and 94% identity, respectively. The phylogenetic tree also showed the relationships of the $eta$-lactamase gene of Bacillus sp. J105 to genetically related that of other Bacillus strains. Analysis of expression pattern of the pKL11-${Delta}4.6$ in E. coli, revealed that the secretion efficiency of $eta$-lactamase was $4{sim}5%$ and the molecular weight was as same as that of original $eta$-lactamase (31 kDa) from Bacillus sp. J105.
