싸이토카인은 염증 및 면역 반응의 평가에 있어서 매우 중요한 요소이다. 따라서 이들의 mRNA 수준을 정량하고 평가하는 것은 염증 및 면역 반응을 평가하는데 있어서 그 민감도가 매우 높은 방법으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 SYBR green dye를 이용하여 개의 싸이토카인 mRNA를 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR; qRT-PCR)으로 분석을 할 수 있도록 함에 있다고 할 수 있다. 제작된 시발체(primer)의 최적화된 붙임 온도(annealing temperature; $T_a$)는 인터루킨(interleukin; IL)-$1{eta}$, IL-6, IL-10이 각각 $62^{circ}C$, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)와 tumor necrosis factor (TNF)-${alpha}$가 $60^{circ}C$ 그리고 high mobility group box 1 (HMGB1)이 $58^{circ}C$였다. 표준 정량 곡선을 이용하여 측정한 시발체의 효율성은 97.1%에서 102.%로 매우 높았고, 2차 구조물(secondary structure)과 시발체-이합체 형성(primer-dimer formation)은 융해곡선(melt-curve)분석과 전기영동을 통해 확인하였다. 이렇게 정립된 qRT-PCR 분석법은 민감도와 특이도가 매우 높은 개 싸이토카인 유전자 정량법으로 활용될 수 있을 것이다.
Cytokines are important mediators of the immune response, and quantitating cytokine mRNA is a highly sensitive and attractive method for measuring cytokine production. The objective of the current study was to develop and validate a SYBR green quantitative real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) assay for measuring canine cytokine mRNA. The optimal annealing temperatures ($T_a$) of the designed primers were $62^{circ}C$ for interleukin (IL)-$1{eta}$, IL-6 and IL-10; $60^{circ}C$ for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and tumor necrosis factor (TNF)-${alpha}$; and $58^{circ}C$ for high mobility group box 1 (HMGB1). Primer efficiencies of all primers calculated for standard curve samples were between 97.1% and 102.6%. No evidence of secondary structure or primer-dimer formation was seen via melt-curve analysis or gel electrophoresis. The developed qRT-PCR assays are highly specific and sensitive and can be used to quantify gene expression levels of canine cytokines.
