- 출아효모에서 연속적 δ-sequence 삽입유도에 의한 β-1,3-glucanase 활성 증가
- ㆍ 저자명
- 김민정,김연희,Kim. Min-Jung,Kim. Yeon-Hee
- ㆍ 간행물명
- 생명과학회지
- ㆍ 권/호정보
- 2014년|24권 10호|pp.1046-1054 (9 pages)
- ㆍ 발행정보
- 한국생명과학회
- ㆍ 파일정보
- 정기간행물| PDF텍스트
- ㆍ 주제분야
- 기타
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${eta}$-1,3-glucanase는 다양한 바이오공정에 널리 사용되어지는 효소로서 산업적 이용가치 증대를 위해 ${eta}$-1,3-glucanase의 대량생산이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 반복서열 ${delta}$-sequence에 의한 integration를 통해 Aspergillus oryzae유래의 ${eta}$-1,3-glucanase (EXGA)의 과발현 유도를 연구하였다. 먼저 효모내의 여러 염색체상에 EXGA 유전자를 integration하기 위해 $pRS{delta}K$-exgA와 $pRS{delta}K$-exgA 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 유전자의 구성적 발현을 위한 ADH1 프로모터, 분비생산을 위한 signal sequence와 ${eta}$-1,3-glucanase유전자의 integration을 위한 ${delta}$-sequence를 포함하고 있다. 먼저 $pRS{delta}K$-exgA 플라스미드를 $BY4742{Delta}exg1$ 균주에 형질전환하고, 재조합 ${eta}$-1.3-glucanase가 안정하게 과발현 및 분비생산됨을 확인하였다. 다음으로 geneticin 선별을 통한 integration 유도와 ${eta}$-1,3-glucanase 활성과의 관계를 조사해보기 위해 $pRS{delta}K$-exgA 플라스미드를 $BY4742{Delta}exg1$ (YKY082) 균주에 도입한 결과, geneticin 농도 증가에 따라 ${eta}$-1,3-glucanase 활성도 증가되었고, geneticin 농도 0.8 mg/ml가 ${eta}$-1,3-glucanase과발현에 적합한 농도임을 확인 할 수 있었다. 이어서 $pRS{delta}K$-exgA 플라스미드는 연속적 ${delta}$-integration에 의해 효모세포 내에 도입되어, 한번, 두번, 세번 그리고 네번의 integration에 의해 ${eta}$-1,3-glucanase의 비활성은 0.063, 0.095, 0.131 그리고 0.165 unit/ml/$OD_{600}$로 증가되었다. 또한 연속적 integration에 의해 ${eta}$-1,3-glucanase의 활성이 증가됨에 따라 다양한 염색체에 도입된 EXGA 유전자의 복제수(integration 빈도)도 같이 증가되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 반복적 ${delta}$-sequence integration방법을 통해 재조합 ${eta}$-1,3-glucanase의 활성을 점진적으로 안정하게 증가시킬 수 있음을 제시하였다.
Beta-1,3-glucanase is widely used in various biotechnological and industrial processes, with over-production required to enable versatile utilization. We examined the overexpression of ${eta}$-1,3-glucanase (EXGA) from Aspergillus oryzae using ${delta}$-sequence-mediated integration. We constructed $pRS{delta}$-exgA and $pRS{delta}K$-exgA plasmids for integration of the EXGA gene into various chromosomes of Saccharomyces cerevisiae. These plasmids contain the ADH1 promoter for constitutive expression, a signal sequence (exoinulinase signal sequence [INU1 s.s]) for secretory production, and a ${delta}$-sequence for integration of ${eta}$-1,3-glucanase. The $pRS{delta}$-exgA plasmid was transformed into the S. cerevisiae $BY4742{Delta}exg1$ strain, and ${eta}$-1.3-glucanase was stably overexpressed and secreted. Another plasmid, $pRS{delta}K$-exgA, was introduced into the S. cerevisiae $BY4742{Delta}exg1$ (YKY082) strain, and overexpression of ${eta}$-1,3-glucanase was examined by inducible integration under geneticin selection. The activity of ${eta}$-1,3-glucanase increased in accordance with a rise in the geneticin concentration, with 0.8 mg/ml of geneticin suitable for overexpression of ${eta}$-1,3-glucanase. Subsequently, $pRS{delta}K$-exgA was repeatedly transformed for sequential ${delta}$-integration. The activity of ${eta}$-1,3-glucanase reached about 0.063 unit/ml/$OD_{600}$, 0.095 unit/ml/$OD_{600}$, 0.131 unit/ml/$OD_{600}$ and 0.165 unit/ml/$OD_{600}$ by the first, second, third, and fourth round of integration, respectively. According to the increase in the activity of ${eta}$-1,3-glucanase by sequential ${delta}$-integration, the copy number (integration rate) of the EXGA gene also increased in various chromosomes. These results suggest that recombinant ${eta}$-1,3-glucanase activity can be sequentially increased by repeated ${delta}$-sequence integration.