Klebsiella pneumoniae로부터 nifA 유전자를 크로닝하여 Azospirillum에 도입 발현시킴으로서 암모니아 비제어 질소고정을 유도하고자 하였다. Azospirillum 숙주에서 안정하게 복제 유지될 수 있는 vector로서 RK2 (IncP-1 group plasmid) 변형 vector인 pRK290과 pVK100를 선별하였으며 pKT230 (RSF1010 변형 vector, IncQ group) 및 pSa151(pSa 변형 vector, IncW group)는 불안정하였다. nifA 유전자 크로닝은 nifA 3.0 kb Sal1 절편을 pRK290의 Bgl II 위치에 그리고 pVK100의 Xho1 위치에 각각 크로닝하고 pMK23 및 pMK26으로 명명하였다. pMK23에서 nifA의 발현은 $Tc^r$ 유전자 promoter pMK 26에서는 $Km^r$ 유전자 promoter에 의하여 constitutive expression을 유도하였다. A lipoferum KY 6 에서는 16mM의 암모니아 첨가로 질소고정효소의 발현이 완전히 억제되었으나 A.lipoferum KY6 (pMK23) 및 A.lipoferum KY6 (pMK26)에서는 암모니아를 첨가하지 않았을 경우의 질소고정력의 18% 및 10%를 나타내므로써 K. pneumoniae nifA 유전자의 Azospirillum에서 발현이 확인되었다. 한편 암모니아 존재하에서의 질소고정 효소 합성도 전기영동 결과 확인되었다.
The nifA gene in the 3.0 kb SalI fragment from the nifA gene cluster of Klebsiella pneumoniae was cloned into BglII site of pRK290 and XhoI site of pVK100, a derivative of a wide host range plasmid RK2(Inc P-1 group) and named pMK23 and pMK26, respectively. The constructed pMK23 and pMK26 carring nifA gene could be introduced into Azospirillum by transformation and conjugation with the helper plasmid pRK2013 and maintained stably in the host in constrast to some instability of RSF1010 (Inc Q group) or pSa (Inc W group)-derived vector. The nifA gene in the former recombinant nifA plasmid was expressed under the $Tc^r$ gene promoter of pRK290 and the latter under the $Km^r$ gene promoter of pVK100 in the Azospirillum host. The degree of derepression of the nitrogenase activity by the nifA expression from K. pneumoniae in the presence of 16mM ammonia was about 18% in A. lipoferum (pMK23) and 10% in A. lipoferum (pMK26) compared to the nitrogenase activity in the absence of fixed nitrogen. Different level of MoFe-protein (nitrogenase component I) and Fe-protein (nitrogenase component II) synthesis between nifA plasmid introduced Azospirillum transconjugant and wild type were observed in the cells grown with the fixed nitrogen.
