M13 벡타에 반대방향으로 클로닝된 DNA 절편이 서로 결합한 이중가닥 DNA와 단일가닥 벡타 DNA를 포함하고 있는 부분적으로 혼성체화 된 구조를 형성하게 하였다. 이 혼성체 구조를 제한효소 HaeIII, HinfI 또는 Sau3AI으로 처리하였을 때 삽입된 DNA가 선택적으로 절단되어 이중가닥 DNA 절편과 단일가닥 벡타 DNA가 생성되었다. 이 중 Sau3AI의 작용을 자세히 조사하였다. 그 결과 이 반응에서 8자형 DNA의 이완작용이나 비선택적 절단이 속도결정단계가 아니라는 것을 밝혔다. 8자형 DNA에서 결합된 다중연결자에 존재하는 BamHI 자리는 Sau3AI에 의하여 절단되지만 BamHI에 의해서는 절단되지 않는다. 이 사실은 이 자리에서의 DNA 구조가 효소작용에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 삽입된 DNA로부터 유도된 이중가닥 DNA 절편을 이 방법으로 얻어 디데옥시 염기결합 순서 결정법의 시발물질로 사용하였다. 이를 이용하여 단일가닥 벡타에 클로닝된 긴 DNA의 염기결합 순서를 결정하는 방법을 제안하였다.
DNA fragments cloned in opposite orientations into M13 vectors were allowed to associate, generating partially hybridized structures containing both double-stranded insert DNA and single-stranded vector DNA. When these structure ("Figure 8 DNA") were treated with restriction enzymes, HaeIII, HinfI, or Sau3AI, the insert DNA was cleaved preferentially to yield double-stranded fragments and single-stranded vector DNA. The action of Sau3AI was examined in detail; the results indicate that neither relaxation nor nonspecific cleavage of the "Figure" DNA was rate-limiting in the reaction. The BamHI site in the associated polylinker sequence of "Figure 8" DNA was cleaved by Sau3AI but not BamHI, suggesting that DNA structure mediated enzyme action at this site. Double-stranded fragments derived by this procedure from the insert region were used to prime dideoxy sequencing reactions in the clones from which they were derived. A sequencing scheme for long DNAs cloned into single-stranded vectors is proposed.
